Validation of an analytical method using an anion-exchange monolithic column for the assessment of supercoiled plasmid DNA

Abstract

Nos últimos anos tem aumentado a exigência para obtenção de DNA plasmídico superenrolado de elevada pureza de forma a ser aplicado como vector em novas estratégias terapêuticas, como a terapia génica ou as vacinas de DNA. Assim, é necessário implementar uma técnica analítica adequada para controlar a qualidade do plasmídeo superenrolado, como um produto farmacêutico, durante o processo de produção. O presente estudo descreve o desenvolvimento de uma nova metodologia para quantificar e controlar a pureza do plasmídeo superenrolado, usando uma coluna monolítica que se baseia em cromatografia de troca aniónica. Este método analítico com detecção UV permite a separação das isoformas do plasmídeo, usando um gradiente por passos de NaCl. Avaliou-se a selectividade, linearidade, exatidão, reprodutibilidade e repetibilidade do método, e também se estabeleceram os limites inferiores de quantificação e de detecção. A validação foi realizada de acordo com as directivas, sendo demonstrado que o método é preciso e exato até uma concentração de plasmídeo superenrolado de 200 μg/mL. O principal avanço alcançado ao usar este método é a possibilidade de quantificar plasmídeo superenrolado numa amostra contendo outras topologias do plasmídeo, num ensaio de 4 minutos. Esta coluna também possibilita a avaliação de plasmídeo superenrolado presente em amostras mais complexas, permitindo o controlo ao longo do bioprocesso. Assim, estes resultados confirmam a possibilidade de utilizar esta coluna monolítica associada a um método analítico poderoso no controlo do processo “downstream” do plasmídeo superenrolado para aplicações terapêuticas.